O guarda-noturno Larry Daley se estabeleceu em seu papel como zelador dos habitantes mágicos do Museu de História Natural de Nova York. Contudo, ele está prestes a enfrentar o maior desafio de todos os tempos quando, na companhia de seus amigos, descobre que a fonte misteriosa que os traz à vida todas as noites está desaparecendo rapidamente. A busca de Larry por respostas desta vez leva-o para o Museu Britânico, em Londres, onde irá começar um verdadeiro caos da magia. Será que ele vai se...